近期，新加坡国立大学的的LukeLee团队在NatureBiomedicalEngineering上发表题为“Humanmini-brainmodels”的综述文章。
摘要：通过精密微工程学和细胞生物学的融合知识，使人类微型大脑工程化成为可能，从而使系统的研究复杂的神经系统过程和发病机理超出了动物模型所能做到的范围。通过用生理微环境线索培养人脑细胞，人小脑模型可以重构人脑的结构组织和某些复杂的生物学功能。在这篇综述中，我们重点介绍了导致微生理人类迷你脑模型的最重大进展。我们介绍了小脑发育的历史，回顾了在静态条件下创建小脑模型的方法，并讨论了相关的最新动态细胞培养系统。我们还将回顾在重建静态或动态条件下主要神经系统疾病方面的人类迷你脑模型。工程化的人类迷你大脑将有助于推进神经系统疾病的生理学和病因学研究，并为他们开发个性化药物。
背景
人脑协调了中枢神经系统（CNS）的各种功能和机制。它是一个高度动态和复杂的器官，由以高度有序的方式排列的亿个神经元和1万亿个支持性胶质细胞组成。其结构和功能完整性的维持被认为是依赖于衬底输送通过之间的血流量和能量需求从神经活动的微妙平衡。因此，大脑的关键组成部分是血管系统，它将血液与脑组织分开，同时保持体内平衡。因此，脑血管的破坏或血管破裂将不能使有益因子传递到脑实质中，并且将减少从中去除神经毒性提示的可能性。例如，对脑血管系统的一系列机械生物学损伤会导致血源性可溶性因子或血细胞（如中性粒细胞，单核细胞和适应性免疫细胞）的泄漏，激活先天免疫细胞（如星形胶质细胞和小胶质细胞），并且导致神经元受损（图1）。
类脑模型
人类神经系统疾病的发生和发展的研究通常是通过动物模型完成的。例如，动物研究表明，人类淀粉样前体蛋白（APP亚型）基因在转基因小鼠大脑中的表达导致类似于阿尔茨海默氏病（AD）的病理特征的发展，其中包括β-淀粉样蛋白（Aβ）在新皮层和海马中的沉积，神经胶质细胞引起的炎症和tau磷酸化。
但是，动物模型（通常是大鼠）具有局限性：即大鼠和人类中神经元和星形胶质细胞的细胞比例不同，免疫失配，成本高，劳动强度大，通量低且成像可及性差。此外，由于种间差异，大约有来自动物实验结果对人类健康的相关性的问题。因此，需要开发现实的，功能性的大脑模型，以概括人类中枢神经系统的生理特征和反应，以更好地了解大脑机制和人类神经系统疾病的病因。此类生理或病理相关的大脑模型需要生物技术创新。
体外类脑工程模型：自年代以来开发的工程化人类微型大脑是人性化的体外模型，该模型整合了人类大脑的最小功能单元，并概括了健康或患病大脑的微生理线索。生物材料的工程和先进细胞的融合生物学-特别是体细胞到诱导多能干细胞（iPS细胞）的重新编程，以分化成神经细胞通过先进的基因组编辑技术（CRISPR-Cas9）-使得能够开发复杂，简单的二维（2D）或三维（3D）人脑模型。这样的小脑模型对脑功能产生了见识，并有助于理解关于人类神经系统疾病进展的一些长期假设，例如导致痴呆的神经血管系统功能障碍和蛋白质堆积。机构（如Aβ11和α突触核蛋白），导致神经炎症。工程化的人类微型大脑还提供了关于流动对细胞影响的见解，例如流体剪切应力对血脑屏障（BBB）的影响。在这篇综述中，我们将人类的小脑模型分为两大类：静态培养和动态培养。除非指明是动物来源，否则所有突出显示的模型都使用人类细胞。我们还将讨论人类微型大脑模型开发中的技术进步，以及建立微型大脑以概述神经疾病的生物学和生理学的各种技术的优缺点。我们以人类迷你脑模型的未来发展方向概述为结尾。
静态培养类脑模型
培养皿和Transwell：大约一个世纪前，在培养皿上开发了常规的静态2D细胞培养。此后，关于培养皿神经细胞的培养已经发展到包括iPSC的或神经干细胞的培养时引入分化因子，观察其自我更新或分化成不同的神经细胞类型。年，罗伯特·坎佩诺特（RobertCampenot）在培养皿中引入了第一个体外隔室系统，即所谓的“Campenot小室”，以研究神经生长因子对背根神经节轴突的影响。Campenot腔室包括一个分隔的特氟隆分隔板，该分隔板连接到胶原蛋白涂覆的培养皿上，该培养皿包含一系列用于引导神经生长的平行通道。然而，制造和组装这些腔室是具有挑战性的，并且它们与高分辨率光学成像的兼容性有限。而且，尽管培养皿培养是健壮和直接的，但对于复杂的生物学研究（例如涉及细胞间通信，细胞发育以及物理和化学线索受控运输的研究），仍需要能够在生理上相关的动态微环境的系统。此外，培养皿或孔板不适合研究剂量反应关系和药物传输。为了克服这些限制，Transwell被开发和用于保持单一种植或内皮细胞，神经胶质细胞或免疫细胞的共培养物。Transwell系统也已广泛用于开发BBB模型，因为它具有多孔膜，可将插入物中培养的内皮细胞（代表“血侧”）与底部腔室中的细胞（代表“脑侧”）分开）。这种分隔的多孔系统的最早用途之一是评估淋巴细胞在人脑内皮细胞单层上的迁移。随后，在体内神经血管单位更具代表性通过共培养的脑内皮细胞的神经胶质细胞（星形胶质细胞和周细胞）开发。与单培养相比，这些共培养系统显示出更好的屏障功能和基因表达，并且比动物模型相对更健壮，可重现并且更适合高通量药物筛选。不幸的是，养分，废物以及化学化合物或药物的交换是通过扩散发生的，从而导致这些因子在周围培养基中形成未搅拌的层。在其自然环境中，脑细胞与其细胞外基质（ECM）三维排列。在微环境中模仿这一点的一种方法是将脑细胞嵌入3DECM的凝胶中。通过在3D微环境中培养脑细胞，细胞增殖和分化得到明显改善。例如，可以记录封装在3DMatrigel中并培养5–42天的神经元和神经胶质细胞的自发神经活动。这些简化的系统能够识别关键机制和途径，并提供有关神经生物学的相关见解。但是，它们缺乏多尺度结构和组织-组织界面，因此无法提供检查内皮细胞与周围脑实质细胞之间的细胞间相互作用的可能性。了解这些细胞间的相互作用可以为神经系统疾病的进展提供新的见解。
脑类器官：脑类器官和神经球体可以更好地模拟人脑的细胞结构。这些3D细胞培养物是多细胞组装体，它们可以自我组织以部分形成离散的神经体系结构，并且类似于体内的细胞间相互作用。3D类器官文化最早由罗斯·哈里森（RossHarrison）建立的“悬滴”技术（图2a）开始于年。哈里森将青蛙神经管的组织碎片包裹在附着在玻璃盖玻片上的一滴淋巴液中。然后将这种装置倒置，以使神经纤维生长到培养基中。以后将采用该技术对不同来源的组织进行长时间培养。经典的悬滴技术很简单，但是培养的结果却千差万别。虽然保持了培养的组织学和功能特征，但组织和功能可能会丢失。此外，由于重力，液滴从表面脱离的情况很普遍。
已经建立了许多产生人脑类器官的方法和流程。一种方法是使用神经感应分子来促进细胞聚集和自我组织。细胞聚集的另一种方法涉及使用U形或V形孔（图2A，中间），由于孔的弯曲形状和低的细胞粘附表面，悬浮的细胞被收集在底部以聚集（使用ECM形式的支架支撑物，例如Matrigel，可以在培养过程中改善细胞结构）。该技术已用于产生脑类器官和肠类器官。尽管脑类器官经历快速组织发育和显示出改善的神经片层的极性，质量变化，并且有大量的组织异质性。这在很大程度上可以归因于细胞的自组装和缺乏外部控制。可以通过使用特定的分子，以确定细胞命运或通过预图案化程序改善培养条件来减少这样的变异，如胚状体的预图案化到特定脑区域的命运。这可以通过用SMAD抑制剂（一组蛋白质，它们是转化生长因子β；TGF-β受体的主要信号转导子），如dorsomorphin和A-38，处理人iPSC，然后将细胞包埋在基质胶中，并在小型旋转生物反应器中进一步培养类器官。另一种方法涉及人类PSC（hPSCs）的分化，以产生类似于背大脑皮层或大脑皮下层的区域特异性前脑类器官。然后，这些类器官的融合（图2a，底部）会导致形成较大的类器官，从而允许对中间神经元进行迁移研究。或者，通过使用纤维微丝，可以指导或约束神经细胞的生长。尽管该技术可以形成更大的组织，且具有更大的表面体积比，但仍保持了紧密的细胞间接触和自组织。
脑-类器官技术为个性化医学提供了可能性。通过使用患者细胞或通过用的iPSC或hPSCs组合CRISPR-CAS技术，个性化的脑类器官可以被开发。这样，对致病候选基因的检查和验证可以使疾病发病机理重现。这种个性化的大脑类器官可以促进有效的个性化药物测试和精准医学。尽管脑类器官有许多潜在的应用（从基础发育生物学到疾病建模和治疗方法），但主要缺点之一是缺乏血管形成。在没有灌注的情况下，主要是由于营养缺乏以及气体和废物交换不足，组织坏死是脑类器官中央的常见情况。已经尝试通过使用多个神经细胞和脑内皮细胞使脑类器官血管化，以期产生多尺度的结构和组织-组织界面。血管化的类脑器官可以用来研究血管和脑组织的相互作用以改善药物的输送，并且可以作为研究由血管功能障碍引起的神经系统疾病的更好模型，例如中风和AD。
生物打印：类脑模型生物打印技术可以分为三个主要类别：基于喷墨，压力或微挤出，和激光辅助。在细胞生物打印中，通过堆叠层或通过逐层沉积组装它们来复制计算机辅助设计。这允许在生物打印的构造物内的活细胞和其他生物因子的空间图案化中具有高再现性和准确性。通过喷墨打印，可以将精确的微神经元粘附材料液滴沉积到玻璃基板上，并在其上播种细胞，并且所印刷的图案支持神经胶质细胞培养并指导细胞相互作用（图2b，顶部）。但是，此技术仅限于2D神经元图案化。为了实现复杂的三维神经组织样结构，神经细胞可以直接打印，或在平行于生物材料如纤维蛋白，为3D矩阵。随着3D生物打印逐层沉积生物材料，可以开发多层构造以更好地模仿复杂的大脑结构。例如，通过在交替的胶原层上喷墨印刷大鼠胚胎星形胶质细胞和神经元的悬浮液，生成了3D神经细胞-水凝胶结构（图2b，中）。这种安排使神经细胞和神经胶质细胞种群的离散层得以构建，从而在空间投影中显示出神经的生长和连通性。这些3D构造提供了一种重新创建神经组织功能和发育所需的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的方法。但是，使用当前的生物打印方法，在3D脑模型中生理相关的脑结构和细胞密度的打印仍然具有挑战性。为确保3D打印的构建体允许多种细胞类型以分层方式或以组织样构建体的形式生长和排列，需要考虑两个关键因素：使用适当的生物墨水和印刷后过程。来自生物墨水的生化线索（例如趋化因子，生长因子，粘附因子和信号蛋白）和物理线索（例如ECM的机械和结构特性）促进了细胞存活，运动和分化。因此，生物材料已被广泛地研究以用于3D培养物中的神经。
在当前的生物打印方法中，细胞的选择也受到限制。神经干细胞或iPSC对于重现受损的神经组织的功能和定制3D打印的大脑模型是优选的。但是，由于神经干细胞或iPSC具有非同寻常的特性。首先，hPSC或iPSC作为单细胞的生存能力较差，并且单细胞解离是大多数生物打印过程中的必要步骤。其次，hPSC和iPSC都对环境提示有很高的响应能力，这给操作带来了挑战。部分原因是考虑到细胞固有的类胚胎性质，它们对发育信号的反应。最后，弹性较低的PSC在打印过程中和打印后的条件下无法生存。因此，当实施基于喷嘴的生物打印方法时，需要精准的工艺优化。
微流控技术：已经开发了基于微流体的大脑模型，以在微米级的小室中培养和引导神经细胞，最终目的是更好地复制体内的微环境。这些模型被设计为组装成被简化相关组织构建，功能单元而实际的模型，用于预测器官级响应。为了产生微流体装置，可以通过精密工程和通过操纵微流体装置中的几何因素来模仿体内的机械生物学和生化因素。分区的通道设计可实现紧密接近或直接接触的细胞共培养。因此，组织特异性培养基可以在分开的隔室中维护和取样，同时仍支持多种细胞群体。在这种系统中，分析来自不同细胞群的代谢产物和其他分泌产物也变得可能。这些装置已经被探索用于重构BBB通过培养内皮细胞或通过共培养它们与周皮细胞，神经胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）和神经元。这样的系统可以帮助的毒性和疾病过程的新的生物标志物的鉴定和开发，并且可以作为优异的测试床用于治疗药物疗效和毒性作用。基于隔室的基于微流体的设备也可以用于区分hPSC。此外，微流控基于脑模型用于集成为实时测量的生物化学和生物电子传感器，例如用于监控BBB的内皮通透性跨上皮电阻（TEER）的电极提供的可能性，或微电极阵列用于监测神经元的电活动。与动物模型相比，这些片上大脑设备的另一个关键优势是它们的光学透明性，可以直接进行实时可视化并可以对生物过程进行高分辨率的定量分析。
基于微流体-3D模型BBB已经被开发以解决传统的2D培养系的局限性，并延长平面微流体的能力。最早，最简单的静态微流体3DBBB模型之一包含两个血液隔间，其中包含管状的紧密排列的内皮细胞单层。一系列微通道将血液隔室分隔开，以允许白细胞跨BBB模型迁移。BBB中神经炎症介质的传递和缺血性疾病的发展导致其完整性的破坏。这种3D培养可以帮助理解一些长期存在的问题，这些问题涉及神经细胞群体之间的细胞动力学和代谢差异。
动态培养类脑模型
泵动力系统：在微流体装置的微通道中，外力必须克服通道的阻力才能产生连续的试剂灌注。最常见的方法是将外部泵连接到微芯片的入口或出口。例如，在隔间的片上神经元设备中，连接到处理神经微沟槽的灌注通道出口的注射泵允许受控的层流，同时防止灌注液扩散到微沟槽中（图3a））。这种方法可以模拟体内条件，对神经递质和调节剂进行时间和空间控制。
在体内，BBB血管内皮细胞被连续地暴露于由血流在其顶端表面。再现这些动态体内条件下，在内侧和下脉动合成中空纤维的外壁体外BBB模型共培养的内皮细胞和星形胶质细胞的最早动态流。为了支持细胞的共培养，需要将中空纤维包埋在笨重的塑料室内。但是，需要长时间的培养（9-12天）才能达到严格的屏障。此外，由于纤维壁厚（μm），妨碍了正确的细胞间相互作用。从那时起，微加工技术就被用来改善系统。最早的一个动态的基于微流体-BBB模型的由多层PDMS微通道分离通过的多孔膜具有用于测量TEER集成微电极（图3B）。在动态条件下，记录的TEER值高于常规静态培养的。此外，这样的基于微流体-BBB模型也使在朝向流体剪切应力的内皮细胞应答研究和神经炎性化合物的作用（例如肿瘤坏死因子α;TNF-α）上BBB完整性。正如举例说明通过连续流动的上分化的神经祖细胞和脑类器官的影响（图3C），使用微流体装置的用于培养脑类器官（相对于宏观生物反应器）的主要优点是存在较小的通道尺寸，因此具有较高的表面积体积比。当营养物质不断流动时，这有助于改善营养物质的分配和供应，促进器官发生。
无泵动力系统：尽管基于泵的动态培养系统对于开发功能性大脑模型非常有效，但泵会增加系统的大小并使其更加复杂；但是，有一些技术可以简化这些培养系统的布局，同时又能保持连续流动。一种简单的方法涉及利用静水压力来改变进口和出口储层中液体-大气空气界面的高度，从而产生压力差。这样的装置可以产生流动速率相媲美间质性流速，其可促进分化和神经突延伸神经祖细胞。可以通过这种技术生成化学的空间梯度，该方法还允许对培养的神经元进行Aβ的神经毒理学研究（图3d）。尽管微流体装置中的流体静力驱动的流量很简单，但改变入口储液器的压头可能是一个挑战，这主要是由于微通道内施加压力缺乏动态控制所致。同样，随着时间的流逝，液体从一个储罐流向另一个储罐会导致非线性压力下降，并且微通道中的流量最终会停止（当储罐内的液位达到平衡时）。
产生无泵流的替代技术是在摇摆平台上培养基于微流体的系统，在该平台上，流体介质在两个储层之间循环（图3e）。它被用于体外BBB模型中，该模型将iPSC衍生的人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养在具有高TEER值（峰值为Ωcm–2，与体内条件相当）的多层微芯片中，并且对咖啡因，西咪替丁和阿霉素的渗透性较低。
主要的神经退行病建模
阿尔兹海默症（AD）：Aβ是AD发展的关键因素。淀粉样蛋白级联假说假设，大脑各个部位的Aβ斑块异常聚集是AD病理学中的主要现象。大量研究和一些失败的临床试验表明，这一假设已经过时了，因为无法用Aβ引起的简单线性疾病模型来解释AD。实际上，Aβ不太可能直接导致AD。此外，AD与复杂的生物学和生物化学以及大脑分解的模式有关。Aβ的过度聚集会导致神经原纤维缠结，其中包含过度磷酸化的tau蛋白，这是AD发病机理的另一个特征。在源自人类神经干细胞的3D培养系统中，编码淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和早老素1的基因中的突变导致Aβ和Aβ斑块的细胞外沉积。当在厚厚的3D凝胶中培养时，分化的神经元表达的Aβ水平升高，这导致在体细胞和神经突中形成磷酸化的tau和丝状tau聚集体。
除了开发神经发育研究的脑组织体，类器官可用于神经变性的造型。这可以通过使用患有AD或源自患者的iPSC（来自带有APP的成纤维细胞）的患者的血样生成AD脑类器官培养物来实现。此类脑类器官可以概括AD样病状，如淀粉样蛋白聚集，磷酸化tau蛋白和内体异常。通过用β-分泌酶和γ-分泌酶抑制剂治疗，这些患者源性类器官中的Aβ沉积和tau病理学明显降低。在微流体装置中已经观察到Aβ通过神经元连接的扩散，Aβ对神经元网络和神经胶质细胞的作用以及破坏神经递质和神经营养信号传导（然后可导致突触功能障碍）的Aβ组装体。
帕金森症（PD）：脑类器官可用于研究PD（第二大最常见的神经退行性疾病）的病理。例如，可以通过掺入功能性多巴胺能神经元的中脑类器官来重现神经素样颗粒（多巴胺合成的神经毒性副产物）的产生（图4b，顶部）。PD的标志是多巴胺能神经元的逐渐丧失。通过使用两车道或三车道3D微流体装置，iPSC分化为多巴胺能神经元，对酪氨酸水解酶表现出免疫反应。多巴胺99合成中的倒数第二个酶（图4c）。这种模式可以使个性化药物的发现为PD。
PD的另一个标志是路易体的存在，其主要成分是α-突触核蛋白的丝状包裹体。多巴胺能神经元促进细胞内囊泡中α-突触核蛋白的低聚，但不促进细胞溶质中的α-突触核蛋白的低聚。游离胞质多巴胺水平的增加引起α-突触核蛋白低聚物向细胞外空间的分泌增加，但不引起单体的分泌增加。这可能会导致PD患者中多巴胺能神经元的进行性丧失和神经炎症。隔离微流体装置已用于研究α-突触核蛋白聚集体的细胞内传播（这导致级联的突触功能障碍和神经元细胞死亡）及其对路易小体发病机理的贡献。
有越来越多的证据表明，在线粒体缺陷的运输有助于PD。尽管可以用传统的分离培养系统研究沿轴突体的线粒体运输，但中脑多巴胺能神经元在这些系统中不能长期存活。然而，基于PDMS的微流控设备可用于隔离多巴胺能轴突并确定其方向，以确定逆行和顺行方向，而活细胞成像可用于实时记录轴突线粒体的运动。此类微流体装置促进了PD模拟药物对线粒体运输和其他运输过程的影响研究。
脑癌：多形性胶质母细胞瘤是脑癌的最常见形式，可弥漫性浸润脑组织而不会侵犯血管。已经用具有三个通道的微型设备研究了这种侵略性侵袭的可能机制。装置的中间通道注入了胶原蛋白凝胶，并通过梯形微结构与两个侧面通道隔开，一个侧面包含胶质母细胞瘤细胞，另一个侧面包含内皮细胞（图4c，顶部）。内皮细胞通过胶原凝胶促进胶质母细胞瘤细胞的侵袭。胶质母细胞瘤的进展高度依赖于胶质母细胞瘤相关的巨噬细胞。然而，人们对这些巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞之间的串扰了解甚少。含有胶质母细胞瘤细胞和表现出胶质母细胞瘤特异性表型的巨噬细胞的生物印记微脑揭示，该巨噬细胞被胶质母细胞瘤细胞活跃地募集，并且它们可以诱导胶质母细胞瘤细胞的进展和侵袭。
脑转移是由某些癌细胞从身体其他部位的原发性肿瘤到大脑的系统性循环引起的。为了证明恶性肿瘤可以在大脑和血管腔室之间穿行，一个由原代大鼠脑内皮细胞和星形胶质细胞组成的3DBBB模型（图4c底部）表明，发达的血脑屏障中四种不同的人类癌细胞（乳腺癌，肺癌，黑色素瘤和肝癌）之间的相互作用导致血管和脑室之间遍历恶性肿瘤细胞（肺癌，乳腺癌和黑色素瘤）。相反，当将胶质瘤细胞（一种高侵袭性脑肿瘤细胞）播种到脑室的3D胶原蛋白凝胶中时，它们不会穿透BBB。尽管胶质母细胞瘤很少在中枢神经系统外转移，但神经胶质瘤可发生神经外转移（但是，这种情况很少见，仅占报告病例的2％）。要协调这些关于屏障完整性的不同观察结果，将需要进行深入研究，将其他神经细胞并入并且仅使用人脑细胞，而不是动物和人细胞的组合。
脑外伤（TBI）：血液，脑脊液（CSF）和脑组织是大脑的三个主要组成部分。CSF在突然运动时可将脑组织缓冲在颅骨上，但是当在颅骨的外表面上施加外力（例如，由撞击引起的外力（如果严重，会导致TBI））时，脑组织与颅骨之间的共振会增加接触剪切力应力在脑膜区域。这种急性TBI并发症可导致弥漫性神经元和轴突损伤，并且可以触发进行性神经变性疾病如AD和PD。在大多数钝性颅脑外伤中，大脑承受压缩变形（图1b）。迷你脑模型可用于通过施用控制和可重复的压缩变形来模拟TBI（图4D，顶部）。这样的小型化模型可以提供有关应变作用和应变率的信息，这些应变和应变率是由对神经元寿命和生存力的影响所引起的。
星形胶质细胞是已知参与CNS动态平衡。作为对TBI的反应，星形胶质细胞可调节其对血管破裂，炎症（图1c）和不同程度的轴突损伤的反应性。头部撞击可能会导致BBB功能障碍，阻止产生抗炎和神经增生因子和抑制轴突生长和再生。此外，脑损伤可引起星形胶质细胞反应。当发生这种情况，反应性星形胶质细胞分泌促炎性细胞因子（如TNF-α或α趋化因子）和炎性介质，其最终导致突触损失和神经元死亡（图1c）。为了更好地了解TBI对星形胶质细胞增生的影响，在平行板微流系统中，在培养的星形胶质细胞上产生了模拟TBI的脉冲剪切力（通过压电驱动的伺服压力）（图4d，底部）。这表明星形胶质细胞中钙离子的积累。星形胶质细胞增生的操纵可能有助于确定TBI的新治疗靶标。
总结
人类小脑模型为神经科学研究和脑疾病的个性化治疗提供了机会。小脑模型可以帮助发现不同的免疫细胞和细胞因子对神经毒性和神经炎症的贡献。它们也可能有助于研究神经元微环境中的线索如何调节细胞分化，组织发育，神经系统疾病的进展以及神经组织的愈合和再生机制。
然而，通过使用永生化细胞系，样本量不足，胶质细胞数据不足，使用启动子和不合适的对照（例如使用原代动物细胞而非人类细胞），可能会限制来自小脑模型的洞察力。而且，使用iPSC的模型通常产量低，并且由于遗传和表观遗传变异导致的iPSC变异性，可能难以复制。
脑类器官缺乏血管化仍然是一个主要问题。这导致营养物质和氧气向细胞的输送不足，因此限制了类器官的生长潜力和成熟度。在用于药物筛选的脑类器官中，药物向类器官渗透的减少导致沿类器官半径的药物浓度变化。为了增加脑类器官的灌注，它们已被移植到成年小鼠的皮层中的血管床上。另一种方法是在与脑细胞（或肿瘤细胞）一起培养时，利用内皮细胞自组织为毛细血管状网络的能力。血管类器官的融合也可以促进血管形成和大脑类器官。但是，内皮化的脑类器官缺乏营养物质和废物的灌注。有机体和微流体芯片上的器官技术的整合可能会促进能够在脑部有机体中灌注营养物质和废物的3D血管网络的建立。类器官融合还可以帮助解决以下问题：从外周组织（例如肠道）扩散病理蛋白如何进入大脑会增加PD和其他神经退行性疾病的风险。
当前的3D生物打印技术无法打印具有正常细胞结构和实际细胞密度的脑组织。一个主要的绊脚石是缺乏适当的生物墨水。合适的生物墨水应模仿神经组织的机械行为，但应避免在打印了几层后其结构崩溃。在这方面，由多种天然聚合物（如琼脂糖或胶原蛋白）或合成聚合物（如聚乙二醇或聚乙烯醇）生成的类似于大脑ECM的生物材料具有广阔的前景。此外，生物打印可用于微图案基本信号，例如生物墨水中的特定生长因子，纳米颗粒或活性肽序列，从而在更大范围内提高细胞活力。
在未来的十年，在neurospheroids动态微流体装置和其他混合动力系统可以极大地促进灌注患者衍生的脑模型的发展。此类个性化的大脑模型可能有助于识别与神经系统疾病的发病机制有关的关键信号通路。结合高通量处理流程，微型大脑模型可以帮助开发用于神经退行性疾病的精密医学。迷你脑模型不适用于建立或概括整个活脑的生物学功能。但是，它们可以重建特定的功能单元，从而使神经组织和器官级功能得以重现，以便对发现，诊断，药物开发和个性化疗法进行系统研究。
参考文献
Tan,HY.,Cho,H.Lee,L.P.Humanmini-brainmodels.NatBiomedEng5,11–25().
