人脑类器官的蛋白毒性应激和阿尔茨海默病的 [复制链接]

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研究背景

肿瘤核编码线粒体肽酶（PITRM1）是一种参与线粒体前体加工和降解的线粒体蛋白酶，其突变可导致以小脑共济失调、精神病发作和强迫行为，以及认知功能下降为特征的进展缓慢综合征。本文利用PITRM1敲除的人诱导多能干细胞(iPSCs)产生的皮层神经元和大脑类器官对线粒体前序列加工的发病机制进行研究，提供了UPRmt和线粒体清除对受损的线粒体前序列处理和蛋白*性应激的保护作用的证据。同时也提出了PITRM1相关的神经综合征的新概念，即线粒体前序列加工缺陷诱导UPRmt的早期激活，反过来调节胞质质量控制途径。这项研究为线粒体功能和常见神经退行性蛋白病之间的机制联系提供了支持。

方法流程

肿瘤本文构建了PITRM1基因敲除的人诱导多能干细胞，利用2D神经元和3D脑类器官模型系统，使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、westernblot和免疫印迹方法研究了线粒体功能和蛋白质稳态间的作用。

研究结果

1

PITRM1敲除的iPSC衍生神经元发生线粒体功能障碍

肿瘤使用CRISPR/Cas9技术，生成了PITRM1基因缺失（PITRM1?/?）的人类iPSC，将PITRM1+/+和PITRM1?/?iPSCs分化为神经元培养物，都有效地产生了皮层神经元。已知PITRM1缺陷导致未降解线粒体靶向序列（MTS）的积累，而这些序列反过来又损害了线粒体基质前序肽酶（MPP）对前序列蛋白的处理，由于MTS肽能与膜结合，干扰线粒体的电化学梯度，因此文章中检测了PITRM1缺陷对线粒体膜电位和呼吸氧化活性的影响性。PITRM1?/?神经元的线粒体膜电位降低，这种减少在神经突起中比在胞体中更明显。

2

PITRM1?/?iPSC衍生的皮质神经元显示线粒体应激反应的诱导和有丝分裂的增强

肿瘤线粒体应激反应已被确定为几种神经退行性疾病和原发性线粒体疾病的共同特征。通过对相关基因表达水平的检测，发现PITRM1?/?iPSC衍生的皮质神经元表现出对UPRmt/mtISR转录物的显著诱导，导致ISR通路的强烈上调。ISR已被证明能激活自噬，利用免疫染色和westernblot评估自噬体的含量，发现PITRM1?/?神经元中LC3（自噬体的标志物）基础水平降低，自噬通量显著增加，同时，对PITRM1+/+和PITRM1?/?iPSC来源的皮质神经元中的线粒体进行纯化后检测发现PITRM1?/?神经元的线粒体含量较低。这些结果都表明PITRM1功能的丧失提高了线粒体的清除率。

3

PITRM1?/?iPSC来源的神经元显示APP的累积和Aβ水平的增加

为了通过westernblot检测淀粉样前体蛋白（APP）的水平，发现PITRM1?/?神经元的APP蛋白水平显著增加。然后使用MSD免疫分析法对来自PITRM1+/+和PITRM1?/?iPSC皮层神经元的上清液进行分析，发现PITRM1?/?神经元有更高水平的Aβ40和Aβ42肽，并且Aβ42/Aβ40比率增加。接下来，通过westernblot检测泛素化蛋白质的水平，观察到PITRM1?/?显示泛素化蛋白质水平增加，这表明细胞蛋白质稳态存在缺陷。

4

PITRM1?/?脑类器官的scRNA-seq揭示了对细胞类型的特异性影响

为了为了进一步研究PITRM1神经*性的机制，使用scRNA-seq对2个月的大脑类器官进行转录分析，确定了26个细胞簇，分别是NPC、放射状胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞，以及其他胶质细胞类型。在PITRM1+/+和PITRM1?/?中，所有细胞簇都有60%的细胞表达神经元谱系标记，几乎20%的细胞表达胶质细胞标记。在不同的细胞簇中进行通路分析，发现线粒体功能、氧化磷酸化和sirtuin途径是神经元、胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞之间的共同失调途径。根据PITRM1缺乏对免疫途径的影响，作者发现在PITRM1?/?大脑类器官中炎性细胞因子TNF-α显著增加。

5

PITRM1?/?脑类器官表现出AD病理的主要特征和诱导线粒体的应激反应

为了Westernblotting和免疫荧光染色显示2个月大的PITRM1?/?脑类器官中APP的累积和Aβ水平的增加。同时在PITRM1?/?iPSCs产生的脑类器官中检测到BTA-1和硫*素阳性聚集物，表明蛋白质沉积被组织成淀粉样聚集物，这类似于在阿尔茨海默症（AD）斑块中观察到的聚集物。接下来，对2个月大的PITRM1+/+和PITRM1?/?脑类器官中UPRmt相关基因的表达水平进行分析发现，PITRM1?/?脑类器官表现出UPRmt转录本的显著上调（ATF4、DDIT3、HSP60、HSPA9、ERO1）。此外，与对照组相比，PITRM1?/?脑类器官中线粒体蛋白酶LONP1和CLPP的基因表达也显著上调。

6

UPRmt的抑制加剧了Aβ蛋白*性

为了已知UPRmt可延长多种生物体的寿命，为了确定PITRM1?/?脑类器官中观察到的UPRmt诱导是否可以作为一种保护机制来对抗线粒体蛋白成熟和aβ蛋白*性的缺陷。因此，每天使用ISRIB（一种整体ISR抑制剂）治疗脑类器官，发现ISRIB治疗的PITRM1+/+脑类器官显示裂解的caspase-3阳性细胞显著增加。有趣的是，ISRIB治疗的脑类器官也显示出线粒体DNA的增加，这表明UPRmt的抑制导致线粒体清除率的降低。

7

通过NAD+前体增强线粒体自噬改善Aβ蛋白*性

为了由于线粒体自噬缺陷已被证明导致阿尔茨海默病，ISRIB处理的脑类器官显示线粒体清除减少和AD样表型的恶化，作者为了研究增强线粒体清除是否能改善PITRM1相关线粒体神经退行性变中的AD样表型，使用NMN（一种NAD+增强剂）处理PITRM1+/+和PITRM1?/?大脑类器官，数据表明NAD+增强剂在生理和病理条件下的不同作用，即分别诱导线粒体生物合成或增强线粒体清除。此外，NMN处理显著降低了PITRM1?/?脑类器官中裂解的caspase-3阳性细胞的数量。

研究结论

该研本文报道了一种新的人类PITRM1缺陷的细胞模型，利用人类iPSC衍生的皮层神经元和脑类器官，表明PITRM1功能的丧失导致了与在阿尔茨海默病中观察到的相似的病理学特征。此外，作者发现增强UPRmt和线粒体自噬可改善原发性线粒体疾病相关神经退行性病变的神经病理特征。重要的是，尽管人类PITRM1突变相对罕见，但本研究中描述的疾病机制可能同时适用于原发性线粒体疾病和更常见的成人发病的神经系统疾病。因此，这项数据提供了原发性线粒体疾病和常见神经退行性蛋白病之间的机制联系。

参考文献

MaríaJoséPérez,DinaIvanyuket,MichelaDeleidi,etal.LossoffunctionofthemitochondrialpeptidasePITRM1inducesproteotoxicstressandAlzheimer’sdisease-likepathologyinhumancerebralorganoids.Mol.Psychiatry.;7.

-THEEND-

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