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HPV定量检测的临床意义与研究进展 [复制链接]

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作者:王轶英、王悦、孔北华、WenxinZheng

选自:中华妇产科杂志年8月第52卷第8期第-页

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,也是目前唯一的病因明确的恶性肿瘤。年的统计表明,全球每年子宫颈癌的死亡病例数达27万;其中约1/4来自中国。近年,子宫颈癌的发病率和死亡率在上升,且明显趋向年轻化。自年国际癌症研究中心(InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC)正式宣布HPV的某些型别持续感染是导致子宫颈癌的最主要因素以来,迄今已发现HPV的余种型别,依据致癌性分为高危型及低危型。

不同型别的HPV致癌性和致癌率均有差异。HPV感染的型别因地域的不同而不同,如在西方国家最常见的型别为HPV16、18,HPV45主要出现在非洲西部地区,而中国妇女的感染型别主要为HPV16、18、58、52。鉴于HPV16和18是致癌性最强的两个型别[1-3],美国阴道镜和子宫颈病理学会(ASCCP)将HPV16和(或)18阳性直接列为阴道镜检查的指征。除了病毒型别,HPV的持续感染也是子宫颈癌发生的必要条件。同一高危型HPV的持续感染者发生子宫颈癌的风险远高于不同型别反复感染者,因此,了解HPV型别、并区别感染是持续性还是一过性非常重要。

除HPV的高危型及持续感染外,病毒感染的数量即单位细胞内的病毒载量在子宫颈癌的进展中也有一定的意义。目前,以HPV载量预测病毒的清除及疾病进展也成为重要的研究方向。监测HPV载量涉及到病毒感染的细胞数以及感染细胞中的病毒量,影响因素主要包括HPV感染子宫颈黏膜表面的范围和感染区域的病毒数量。但获取受检妇女子宫颈脱落细胞的数量不易控制,截至目前,18个高危型HPV同时进行分型及定量分析的研究较少。然而,在病毒载量与子宫颈癌关系的研究中,不少研究者认为,病毒载量是除型别和持续感染之外导致肿瘤发生发展的另一关键的独立因素[4-5]。但是有关病毒载量与致病性的关系,也有不同结论[6]。因此,本文就HPV定量检测是否有临床意义的相关研究进行综述。

一、HPV的定量检测方法

针对高危型HPV的定量检测,常用的方法有第2代杂交捕获(HC-Ⅱ)、荧光定量PCR(fqPCR)和以PCR技术为基础的其他方法。

1.HC-Ⅱ:又称基因杂交体信号放大技术,采用免疫技术并通过化学发光使基因信号放大。

HC-Ⅱ是目前用于HPV半定量研究最常见的方法,由于其有成品的试剂盒,在国际上广泛使用[7],因而有大量应用HC-Ⅱ方法研究HPV的数据。但其仅为半定量方法,不能对受试标本的细胞数进行定量,无法排除由于不同细胞数量导致的偏差,无论单次病毒检测还是在随访中动态监测病毒载量,均缺乏准确性;又因其无法区分13种高危型HPV的具体型别,故无法明确型别特异性的病毒载量及辨别多重感染中的优势型别。鉴于此,HC-Ⅱ检测阳性的病例,应再采用其他方法明确分型。例如,美国国立卫生研究院(NIH)用此方法得出结论:高级别宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN;即CINⅡ、CINⅢ)和子宫颈癌与HPV16型的病毒高负荷密切相关。

2.fqPCR技术:即在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过循环阈值(Ct值)和标准曲线对起始模板进行定量分析。

fqPCR是目前被普遍认可的病毒载量检测的标准方法[4-5,8]。对HPV的检测,从定量准确度上看,可以体现为病毒DNA含量(拷贝数)和单位细胞内病毒数的精确定量。前者作为普通的定量方法,只是半定量,因此不能将标本中的子宫颈脱落细胞数进行标准化,其定量也同HC-Ⅱ一样缺乏准确性;而后者的精确定量,则是通过有核细胞内的看家基因获得单位细胞的病毒载量,即获得医师取样的细胞数量及其的相对病毒含量,可更进一步反映真实的病毒感染程度,该方法尚无商业化的试剂盒,因而还不能用于进行大样本量的临床研究,且其敏感度及定量检测标准不统一,各研究的结论间没有严格的可比性。这也是限制该方法迅速发展的主要因素。因此,目前以单拷贝基因作为看家基因,计算脱落细胞数,对不同型别做进一步的精确定量,结合大量的临床研究来观察HPV载量与子宫颈病变的程度已成为研究方向[9]。

然而,应用有核细胞看家基因作为估算脱落细胞数的方法也有缺陷。HPV感染是在上皮细胞内,而子宫颈脱落细胞标本中则还含有炎症细胞,且炎症细胞数量因患者及炎症程度而异,这是fqPCR目前尚未解决的技术问题。

3.其他方法:采用其他建立在PCR技术基础之上的方法来确定病毒载量,统称为PCR+法。

如Trevisan等[10]的研究对PCR产物的吸光度进行定量测定,以fqPCR技术作为对照,其对病毒载量的测定结果类似。Schmitt等[11]的研究采用广谱PCR多通量HPV分型检测法获得PCR产物,自定义单位,确定病毒载量的界值(cut-off值)来判断检测值的高低。Wentzensen等[4]采用线性阵列法(lineararray法)对HPV的5种型别(16、18、31、33、52)检测吸光度并分析载量,用PCR信号强度确定病毒载量。各种方法建立后大多以fqPCR技术为“金标准”来确定其准确性,其敏感度都不及fqPCR,同时也无法避免fqPCR技术的缺陷。

二、HPV定量检测的临床意义

HPV定量检测以相对或绝对数值的形式报告病毒载量,与单纯的定性检测比较,能够以量化形式具体反映HPV在病变部位的感染状态,但如何正确应用这一技术并结合临床对病毒载量数据进行解释还存在一系列问题。不少研究提示,在子宫颈标本中高危型HPV的病毒载量(尤其是HPV16型)可作为HPV持续感染以及CIN发生风险的指示因子[12],且病毒载量与病毒持续感染和型别也存在一定的关系。

1.HPV载量与病毒持续感染的关系:多数妇女的HPV感染为一过性,通常在感染后6~24个月内被免疫系统清除,只有少数高危型HPV的持续感染与子宫颈癌的发生有直接关系[10]。

HPV病毒高载量是持续感染的重要内因,如Trevisan等[10]通过低密度PCR、fqPCR技术检测例妇女的HPV16载量,随访7年中HPV16的清除情况,结果显示,初次检测时病毒载量越高,病毒越难以清除;同时,病毒载量的高低与感染的持续时间正相关。有学者采用HC-Ⅱ法检测发现,高危型HPV感染持续在12个月以上时,增加了CINⅢ及子宫颈癌的发生风险。当高危型HPVDNA10ng/L时,机体的免疫系统易于清除病毒,而≥10ng/L时易于导致持续感染。Carcopino等[13]的研究也发现,初期HPV16载量的高低与最终病毒的清除与否高度相关;该研究显示,初期感染病毒为中低载量(1.5×拷贝/百万细胞)者,HPV在随访的2年间被清除,而持续感染者往往初期感染病毒的载量较高(3.8×拷贝/百万细胞),两组有显著性差异。这与其他研究的结论类似。因而,高危型HPV(尤其是HPV16)伴有高载量已被认为是持续感染的候选标志,可能用于预测癌前病变。

2.HPV载量和型别与子宫颈癌发生的关系:近年,一些学者发现,HPV载量是子宫颈癌的1个型别特异性生物指标[14-15],而每个型别病毒载量的临床意义也不尽相同。

不少研究提示,HPV16、31、33、52的病毒载量与CIN病变呈正相关[9];而HPV18是易于导致子宫颈腺癌的型别,然而有关HPV18载量与CIN和腺病变等级间的关系尚存在争议[7]。

一些研究认为,HPV58的病毒载量与病变等级无相关性。原因可能在于不同的HPV型别本身具有不同的生物学活性,从而导致载量与病理进程的关系不一致[16]。HPV感染常见多重感染,可为高、低危型混合性或两种以上的高危型HPV感染,高病毒载量的子宫颈癌癌前病变发生风险在多重感染中比单一型别感染中高4~6倍[11]。尽管目前的研究还不充分,但可基本确定病毒载量与子宫颈病变的相关性与HPV型别有关,不同型别呈现不同的相关趋势;HPV16的病毒载量与子宫颈病变显著相关,这一发现是制订子宫颈癌防治策略有力的参考依据,而其他型别尚无定论。

鉴于高危型HPV型别及持续感染是子宫颈高级别病变或者子宫颈癌发生的重要相关条件,因此,有关病毒载量的研究必须建立在分型检测的基础上,从HPV感染的自然史中获取有效信息,并解释HPV载量与疾病的相关性。

3.HPV载量与细胞学和病理发现的关系:HPV检测具有敏感度高的特点,年美国基于多中心研究的临床指南,已将HPV检测纳入到子宫颈癌的早期筛查手段[17]。

HPV检测作为客观指标,能有效弥补细胞学检查假阴性率高的缺陷。而高危型HPV定量检测又较定性检测有更好的预测价值,高病毒载量可提示细胞学异常,成为子宫颈癌早期筛查中重要的辅助诊断指标之一。有研究发现,高病毒载量与细胞学异常的关系显著[18-19],如Bigras和deMarval[20]的研究采用HC-Ⅱ法检测HPV,发现随着病毒载量的升高,≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)病变的比率升高,细胞学检查的假阴性率明显降低,说明高病毒载量提示高度病变风险。其他学者采用HC-Ⅱ法及fqPCR技术进行的研究也得出了一致结论,高病毒载量的妇女CIN和子宫颈癌的发生率更高,CIN病变的级别随着病毒载量的增加而上升,其中高度鳞状上皮内病变(HSIL)的病毒载量最高。最近1项包含例妇女的子宫颈癌筛查研究[21],采用fqPCR技术通过相对载量区分细胞学正常与异常,敏感度为75%,特异度为80%,支持将HPV载量作为子宫颈疾病的潜在生物指标。通过设定单位细胞中HPV载量的临床界值对子宫颈正常和(或)良性病变与CIN、以及低级别鳞状上皮内病变(LSIL)与HSIL和(或)癌可进行基本分类[4,8-9,22-23]。有研究将HPV16定量检测用于区分HSIL与LSIL,敏感度为50%,特异度达到90%。也有研究发现,检测HPV载量区分CINⅠ与CINⅡ+(即CINⅡ、CINⅢ或癌)的敏感度显著高于单独的细胞学检测,但特异度不佳[8]。目前,HPV16型是唯一有大量数据支撑的、可以预测病毒持续感染及癌前病变进程的型别,对于其他HPV型别以及如何设定HPV载量的临床界值还需进行大样本量的研究,寻求统一的定量评估标准。

由于子宫颈高病毒载量与其持续感染、病变等级及其进展有密切联系[24],检测HPV载量有助于提高临床的阳性预测值。值得注意的是,高危型HPV高载量对即使细胞学阴性的妇女仍属于高危因素,这些妇女有进展为HSIL+病变(即CINⅡ、CINⅢ或癌)的风险[25]。当细胞学结果判读为LSIL,但高危型HPV载量高于临床界值时,也应行阴道镜检查。对于以HPV检测作为主要的筛查方法、但缺乏高质量的细胞学筛查时,有研究提示,可采用HPV定量检测替代阴道镜进行进一步的诊断[26],可避免对患者进行盲目或过度的侵入性检查。然而,这是否能应用于临床,有待于进一步研究。

4.HPV载量与子宫颈病变风险的预测及随访:高HPV载量可以预测CIN的发生风险。

如新近的研究,对细胞学正常的妇女进行HC-Ⅱ定量及型别分析,分别以单一HPV型别研究其临床预测性,经过约11年、对例HPV阳性妇女的随访,发现HPV16的绝对风险系数最高,其次是HPV18、31、33;作者发现,HPV16或18型感染合并高病毒载量与≥CINⅢ的发生风险紧密相关;在不同的病毒载量(1.0~9.9、10.0~99.9、≥.0ng/L)情况下进展为≥CINⅢ的风险比,HPV16分别为1.0、1.8、2.0,HPV18分别为1.0、1.2、2.8。筛查HPV16型单一感染,当HPV16载量提高10倍时进展为≥CINⅢ的风险增高34%,表明HPV16载量较之仅简单行分型检测更有临床意义。Schlecht等[27]的研究对例HPV阳性妇女进行持续近6年的随访,并在前2次随访中检测病毒载量,观察病毒载量与后续发生细胞学异常的关系,结果发现,随着病毒载量增加,CIN的发生率明显升高,单个细胞中的病毒拷贝数在细胞学阴性组为2.2,1次细胞学阳性为6.2,2次为8.9,3次以上细胞学阳性的病毒拷贝数为18.7,显示子宫颈的损伤风险随着病毒载量的升高而加大。对于未发现细胞学异常的妇女,病毒的高载量可提示有HPV持续感染的可能。有报道,子宫颈原位癌易发生在HPV16型持续高病毒载量者,以10年为诊断周期,HPV16高载量者的子宫颈原位癌相对风险比HPV16阴性者高30倍。25岁前感染高载量HPV16的妇女中,约25%可能在15年内发展为子宫颈原位癌。观察例子宫颈癌患者,在首次检测后,随后平均7~8年确诊为癌,HPV16载量最高的前20%患者发展为子宫颈癌的风险是HPV16阴性患者的60倍。然而,尽管大量的研究表明HPV载量与疾病进程有关,也有不少病例两者不一致、或出现假阳性和假阴性结果,因此没有临床预测价值[8]。同样,对于HPV18型相关载量的研究来说,与HPV16相比,疾病风险的预测价值不明显[8],究其原因,可能与研究的样本量小、随访周期相对短[13]、研究或病例分组与评估标准不够合理等相关。HC-Ⅱ自身也存在分析不够精确等问题。

三、结论

HPV载量是除型别和持续感染之外导致子宫颈癌发生、发展的另1个关键因素,其是CIN发生的独立影响因子,但尚未成为CINⅢ及子宫颈癌发生的独立影响因子,并且载量只是表明1种感染状态,与子宫颈病变的程度并不完全平行。目前尚无可靠的HPV载量检测方法,成熟的定量检测方法在临床应用前必须做到:(1)可靠的细胞定量技术,这主要包括对炎症细胞数量的评估,进而准确定量单位上皮细胞内的病毒数量;(2)统一的细胞学、阴道镜及组织病理学的判读标准;(3)过硬的临床试验数据支持。总之,HPV载量检测的临床应用有待于详实、可靠的大样本量临床试验的验证。

参考文献:略

本文编辑:沈平虎

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